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Rapid Visual Detection of Pathogenic Streptococcus suis Type 2 through a Recombinase Polymerase Amplification Assay Coupled with Lateral Flow Test

基于重組酶聚合酶恒溫擴增和側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)的高致病性2型豬鏈球菌病原體快速可視化檢測研究

作者：齊永，李巍，李曉玲，沈萬鵬，呂瑞辰，陸年宏，李佳萌，莊素素，徐應(yīng)佳，鄶啟源，沈洪兵，李越希

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種重要的人獸共患病原體，即可引起豬腦膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和敗血癥，亦可引起人腦膜炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、永久性耳聾、中毒性休克樣綜合征等，嚴重者甚至死亡。目前至少已鑒定出29種不同豬鏈球菌血清型，其中以2型豬鏈球菌致病性最強、流行范圍最廣，對公共衛(wèi)生和豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重威脅，并引起了國內(nèi)外廣泛關(guān)注。1998年和2005年，2型豬鏈球菌分別在我國江蘇省和四川省造成人感染大規(guī)模公共衛(wèi)生事件，據(jù)報道其致死率可達40%，在四川疫情中造成了38人死亡。由于缺乏人用疫苗，開發(fā)快速檢測方法及時診斷2型豬鏈球菌感染或被其污染的產(chǎn)品以及常態(tài)化監(jiān)測2型豬鏈球菌在易感動物和人群中的流行情況，將有助于預防和控制2型豬鏈球菌感染引起的公共衛(wèi)生事件。

目前對2型豬鏈球菌的檢測主要依靠微生物培養(yǎng)、血清學檢測和分子生物學檢測方法。微生物培養(yǎng)需要專業(yè)人員在特定生物安全實驗室進行，血清學檢測受限于抗體產(chǎn)生時間，分子生物學方法是目前最常用的方法。如常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、巢式PCR、實時熒光定量PCR等技術(shù)在檢測和鑒定病原體中廣泛應(yīng)用，重組酶聚合酶恒溫擴增（RPA）方法作為近年來興起的一種快速分子檢測技術(shù)，可在37~42 °C恒溫條件下、20 min內(nèi)完成擴增檢測。

2022年5月27日，Zoonoses雜志刊發(fā)了來自華東醫(yī)學生物技術(shù)研究所李越希教授和南京醫(yī)科大學沈洪兵院士團隊最新原創(chuàng)性研究論文《 Rapid Visual Detection of Pathogenic Streptococcus suis Type 2 through a Recombinase Polymerase Amplification Assay Coupled with Lateral Flow Test》（基于重組酶聚合酶恒溫擴增和側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)的高致病性2型豬鏈球菌病原體快速可視化檢測研究）。

在該研究中，研究者針對2型豬鏈球菌特異性基因cps2J構(gòu)建重組質(zhì)粒模板，設(shè)計系列RPA專用引物和探針，并從中篩選到擴增效率高、特異性好的引物組合，用于建立基于RPA和LF的快速可視化檢測反應(yīng)體系。經(jīng)過對反應(yīng)體系進一步優(yōu)化，檢測限<100拷貝/反應(yīng)，檢測可在20 min內(nèi)完成，硬件要求低，整個反應(yīng)過程僅需要一個恒溫裝置，操作簡單、結(jié)果可視。

隨后，作者使用2型豬鏈球菌感染小鼠樣本以及其他病原體的基因組DNA對方法的敏感性和特異性進行評價。結(jié)果顯示，建立的2型豬鏈球菌RPA-LF方法檢測感染小鼠樣本敏感性達到100%；且不與其他用于評價的病原體DNA產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性好。但其敏感性和特異性仍然需要更多的相關(guān)病原體DNA和臨床樣本進一步評價。另外，由于靶標cps2J基因為2型和1/2型豬鏈球菌共有，因此在實際應(yīng)用中解讀檢測結(jié)果需要排除1/2型感染的可能性。

表1 引物和探針序列

綜上所述，該研究首次建立了基于RPA和LF檢測的2型豬鏈球菌快速可視化檢測方法。該方法具有較高的靈敏度和特異性，且不需要精密儀器，在野外和資源有限的地區(qū)具有應(yīng)用潛力。這項工作為未來2型豬鏈球菌感染的臨床檢測和監(jiān)測提供了一個有前途的替代工具。

RPA-LF法的檢測限（A）、特異性（B）及敏感性評價

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https://www.scienceopen.com/hosted-document?doi=10.15212/ZOONOSES-2022-0015